实时定量聚合酶链反应用于控制提取的核酸/cDNA和基因组DNA的质量。为评估所提取的核糖核酸的质量,可建立一种特异性的单拷贝基因系统,用以量化基因组当量和细胞数。而该系统用于对DNA质量控制的概要,使用该系统针对单拷贝基因,使用ct值来确定某些组织的DNA提取质量。超过一定阈值的样本表明dna已经被降解,需要重新获取,而利用系统可对伪基因进行靶向复制。
在准备研磨提取前,我们需要取新鲜的动物组织做样品,剪切成50-100mg左右的湿重,用液氮快速冷冻,在-80℃的低温冰箱中保存。这些被冷冻的组织在DNA提取前,需被放在深孔板中,然后把深孔板放在干冰上进行冷冻。每个孔中需加入研磨钢珠和缓冲液,使其净化溶解。用高通量的研磨仪器将其深孔盖密封,开始研磨提取。
在50℃下样品进行逆转录反应,需加入60微升水,加热5分钟至95℃,在冰上进行冷却,使反应终止。而样品提取的DNA质量是由ct值决定的,是受内源受控的。待超过某一阈值时,样品质量会受到影响,RNA总降解,需要再次提取备用样品。通常用该系统来评DNA的质量,其目标是具有特定物种的甘油醛-3-磷酸脱氢酶或核糖体基因。
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