什么是非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1 仪器：垂直系列电泳槽；低、中、高压电源；恒温循环器

2 试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、考马斯亮蓝\硝酸银、凝胶缓冲液、非变性上样缓冲液、Tris碱、甘氨酸等

聚丙烯酰胺凝胶电泳

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 仪器：垂直系列电泳槽；低、中压电源、恒温循环器 2 试剂：丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺， SDS（十二烷基硫酸钠）溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8）、0.5MTris- HCl(pH6.8）、TEMED、10%(w/v)过硫酸胺溶液、SDS- Page上样缓冲液:（ 0.5M Tris（ pH6.8）缓冲液、甘油、 10%SDS 、二硫苏糖醇、溴酚蓝）、Tris、甘氨酸、SDS 、考马斯亮蓝 \硝酸银等

SDS-Page，在蛋白质裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT

巯基乙醇或DTT可使蛋白质分子中二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。

SDS-PAGE时，在蛋白质裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统

连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。

样品浓缩效应

1）凝胶孔径的不连续性：浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

2）电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带

缓冲体系离子成分及pH值的不连续性

Tris:缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值 Cl-: 在电场中迁移率快，前导离子(leading ion)，快离子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.8的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailing ion），慢离子。当进入 pH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此 Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。高电势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一个均一的电势梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同，表现的泳动率的不同被分开大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。

分子筛效应

大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。

电荷效应

蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。

PAGE电泳据电泳装置不同分为圆盘及垂直的板状两种

前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳；后者凝胶是在两块间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为垂直板状电泳。两者电泳原理完全相同。

蛋白质进行PAGE时，常用垂直板电泳。

垂直板电泳的优越性有：

表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。

在同一块胶板上可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。

胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。

胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。

可进行双向电泳。

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